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Francesca CANUTO

Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Bordeaux
Spécialité Microbiologie – Immunologie

Equipe Mollicutes

Jeudi 7 décembre 2023 - 14h00 - Amphithéâtre Colette et Josy Bové - Campus INRAE Villenave d'Ornon (plan d'accès)

Résumé : La flavescence dorée (FD) est une maladie de la vigne provoquée par un phytoplasme transmis par la cicadelle Scaphoideus titanus. Elle affecte désormais de nombreuses régions viticoles en Europe du sud. Mieux comprendre l’interaction phytoplasme-insecte vecteur pourrait aider au développement de techniques innovantes pour contrôler les épidémies de FD. Le mécanisme de colonisation des tissus de l’insecte vecteur par le phytoplasme n’a pas encore été décrypté mais il a été démontré que la protéine de surface VmpA du phytoplasme FD est une adhésine qui intervient dans les étapes précoces d'adhésion aux cellules du vecteur. La protéine VmpA interagit avec les résidus N-acetyl-glucosamine et mannose portés par les glycoprotéines membranaires de l’insecte vecteur et ses variations de séquence sont corrélés à la capacité de vection par S. titanus. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse était d’identifier les protéines d’insecte interagissant avec la VmpA.
Les protéines des cellules en culture de l’insecte vecteur Euscelidius variegatus (cellules Euva) interagissant in vitro avec la protéine recombinant VmpA-His6 ont été identifiées par spectrométrie de masse. Treize protéines candidates ont été selectionnées en raison de leur proprietés d’interaction avec la VmpA, de la présence dans leur séquence de sites potentiels de N-glycosylation et de segments transmembranaires compatibles avec leur localisation à la surface des cellules. L’étape de validation de l’interaction avec la VmpA a consisté à mesurer l’effet de la baisse de l’expression de ces gènes provoquée par ARN interférence (RNAi) sur l’adhésion de billes fluorescentes recouvertes de VmpA aux cellules Euva. Cette technique de RNAi a été utilisée pour inhiber simultanément l’expression de douze gènes, tout en gardant un niveau d’inhibition comparable à celui obtenu dans le cadre de l’inhibition d’un seul gène. Lorsque l’expression de la protéine uk1_LRR était inhibée, les billes recouvertes de VmpA adhéraient significativement moins aux cellules Euva.
Cette protéine uk1_LRR est constituée de 4 domaines LRR (Leucine Rich Repeat) et les prédictions structurales indiquent qu'elle forme une structure en fer à cheval typique de protéines impliquées dans des interactions protéine-protéine. L’expression de uk1_LRR a été mesurée par PCR en temps réel chez des insectes E. variegatus infectés ou non-infectés par le phytoplasme FD. L’expression de uk1_LRR est restait stable chez les insectes non infectés et chez les insectes infectés une augmentation de son expression a été constatée 7 jours après le début de l’acquisition de phytoplasmes ainsi qu’à 28 jours, probablement suite à une re-ingestion de novo du phytoplasme transmis à la fève durant la latence. Des insectes sains ont été disséqués pour évaluer l’expression de la protéine uk1_LRR dans differents organs par PCR en temps réel: le gène uk1_LRR était 6 fois plus exprimé dans les intestins par rapport aux glandes salivaires et 18 fois plus par rapport aux ovaires. Ces résultats sont compatibles avec une possible implication de la protéine uk1_LRR dans les étapes précoces de l’interaction entre le phytoplasme FD et son insecte vecteur, notamment, dans les phases suivant l’ingestion de la sève infectée.
La technique du double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée pour visualiser d’éventuelles interactions entre la VmpA et l’ensemble des protéines de l’insecte vecteur E. variegatus. Aucun résultat positif d’interaction n’a été obtenu.
En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de ma thèse ont amené à l’identification d’une protéine contenant des domaines LRR impliquée dans l’adhésion de la VmpA du phytoplasme de la flavescence dorée aux cellules en culture de l’insecte vecteur E. variegatus. Le rôle de cette protéine dans la transmission du phytoplasme aux plantes et dans la spécificité de vection reste à confirmer.

Membres du Jury :

Mme BÉBÉAR Cécile, Professeur-PH à l’Université de Bordeaux - Examinateur
Mme BRAULT Véronique, Directrice de Recherche, INRAE Colmar - Rapporteur
Mme MARZACHì Cristina, Directrice de Recherche, IPSP-CNR Turin – Rapporteur
M. SAUVION Nicolas, Ingénieur de Recherche, INRAE PHI-CIRAD Montpellier – Examinateur
M. FOISSAC Xavier, Directeur de Recherche, INRAE Bordeaux - Directeur de thèse